Vitrifikacija nebuvo vienas išradimas. Ji atsirado, kai tyrėjai sprendė skirtingų problemų seką, apimančią ląsteles, embrionus, organus ir, galiausiai, žmogiškąją biostazę.
Užduotis skamba paprastai: atvėsinti vandeniu prisotintą audinį į stiklą, neleidžiant susidaryti žalingų ledo kristalų.
Vykdymas nėra paprastas. Krioprotektantai gali būti toksiški. Jų įvedimas gali deformuoti ląsteles. Didelės struktūros atvėsta netolygiai, kaupia įtampą ir yra daug sunkiau atšildomos.
Šiuolaikinės procedūros yra sistemų, o ne receptų visuma. Jų kokybė priklauso nuo chemijos, perfuzijos, temperatūros, laiko, geometrijos ir matavimų, veikiantys kartu, derinio.
Prieš vitrifikaciją: šaltis sukurdavo antrąją traumą
Ankstyvoji krioprezervacija daugiausia reiškė užšaldymą. Atvėsimas lėtino cheminius procesus, tačiau vanduo kristalizavosi į ledą.
Ledui išstumiant druskas ir kitas tirpiklių daleles į likusį skystį, ląstelės tuo pačiu metu gali patirti mechaninį poslinkį, ekstremalias tirpiklių koncentracijas, dehidrataciją ir membranų pažeidimus.
Greitesnis atvėsimas gali suformuoti mažesnius kristalus, tačiau įprastas vanduo, be cheminės pagalbos, reikalauja nepaprastai didelių greičių, kad virstų stiklu. Tai veikia tik labai plonoms mėginio struktūroms.
Istorinė problema nebuvo tiesiog pasiekti žemą temperatūrą. Tai buvo padaryti neleidžiant vandeniui reorganizuotis į žalingus kristalus.
„1937“ į „1938“: pirmieji kinetiniai vitrifikacijos eksperimentai
Basile Luyet pasiūlė vitrifikaciją kaip biologinės konservavimo strategijos būdą 1937 metais.
„1938“ darbe Luyet ir Eugene Hodapp pranešė apie varlių spermatozoidų judrumo atkūrimą, veikiant skystu oru po dehidracijos koncentruotu sacharozu.
„Jūsų“,pradinis eksperimentaspriklausė nuo mikroskopinių plėvelių ir ekstremalaus aušinimo greičio. Tai parodė fizinį galimumą, o ne apčiuopiamą organų protokolą.
Šis metodas dabar vadinamas kinetine vitrifikacija: aplenkite kristalizaciją, pašalindami šilumą greičiau nei ledas gali susidaryti ir augti.
Mastelis nugali tai. Paviršiaus plotas auga lėčiau nei tūris, todėl didelio mėginio centras negali pakankamai greitai sekti paviršiaus pokyčių.
1949: glicerolis keičia problemą
Christopher Polge, Audrey Smith ir Alan Parkes atrado 1949 tyrime, kad glicerolis gali apsaugoti spermatozoidus žemoje temperatūroje konservuojant.
JūsųNature ataskaita įtvirtino praktinę prasmingų skvarbiųjų krioprotekcinių reagentų svarbą.
Šie molekulės įsiskverbia į ląsteles, jungiasi su vandeniu ir sumažina susidarančio ledo kiekį esant tam tikrai temperatūrai. Jos taip pat sumažina žalojančios tirpalo koncentracijos didėjimą šaldant.
Atradimas pakeitė kriobiologiją, nes aušimo greitis nebebuvo vienintelis kontroliuojamas kintamasis. Cheminė sudėtis galėjo pakeisti vandens fazinio elgesio charakteristikas.
Jis taip pat įvedė naują optimizavimo problemą. Didesnis krioprotektanto kiekis efektyviau slopina ledą, tačiau didina cheminį ir osmosinį pažeidimą.
1959 į 1968: daugiau reagentų ir žingsniškas įkrovimas
„1959“ straipsnyje James Lovelock ir Marcus Bishop pranešė, kad dimetilsulfoksidas (DMSO) apsaugo keletą ląstelių tipų nuo šalčio pažeidimo.
DMSO lengviau prasiskverbė pro kai kurias membranas nei glicerolis. Tai išplėtė ląstelių, kurios galėjo būti krioproteguojamos, spektrą ir išlieka plačiai naudojamas laboratorinėje bei klinikinėje krioprezervacijoje.
Vėliau John Farrant tyrė didinant krioprotektanto koncentraciją, tuo pačiu mažinant temperatūrą, laikant audinį koncentruotame skystyje be specialaus ledo formavimo.
Tai numatė šiuolaikinių protokolų esminį bruožą: žingsniškai įkrauti krioprotektantą žemoje temperatūroje, vietoj to, kad šiltą audinį vienu kartu veiktų pilna koncentracija.
Žingsniškas įkrovimas riboja osmosinį šoką. Žemesnė temperatūra sumažina daugelio cheminių reakcijų greičius ir gali padaryti kitaip žalojančią ekspoziciją tolerantiškesnę.
„1968“ eksperimentai parodė, kad raudonieji kraujo kūneliai galėjo pasiekti skysto azoto temperatūrą be matomo ledo esant pakankamai dideliam glicerolio kiekiui.
Konceptualūs elementai jau buvo. Trūko praktiško būdo pritaikyti juos sudėtingoms, vaskuliarizuotoms audinių struktūroms.
„1984: vitrifikacija tampa organų strategija“
„1984“ straipsnis„Vitrification as an Approach to Cryopreservation“ perinterpretavo vitrifikaciją kaip rimtą kelią organų bankininkystei.
Strategija kartais buvo vadinama pusiausvyros vitrifikacija. Vietoj to, kad reikalautų neįmanomo aušimo greičio, naudojamas pakankamas krioprotektanto kiekis, kad kritinis aušimo greitis būtų pasiekiamas didesnėje sistemoje.
Šis posūkis atskleidė tris tarpusavyje susijusias ribas:
- Sprendimas turi atlaikyti ledą esant pasiekiamoms aušinimo ir šildymo spartoms.
- Organas turi atlaikyti tirpalo įkrovimą ir iškrovimą.
- Krioprotektantas turi pasiekti kiekvieną sritį prieš pradedant aušinti.
Formulė galėtų puikiai veikti mėgintuvėlyje ir nepavykti organe, nes kraujagyslių pasipriešinimas, difuzijos atstumas ar toksiškumas pakeitė rezultatą.
1985: gyvi embrionai grįžta iš stikliškojo būvio
William Rall ir Gregory Fahy pranešė apieledą neįleidžiančią embrionų krioprezervaciją -196°C 1985.
Tai buvo lemiamas biologinis įrodymas. Gyvos branduoliuotos žinduolių ląstelės galėjo išgyventi aušinimą ir atšilimą visiškai stikliškojo būvio metu.
Embrionai vis dar maži. Jų temperatūra ir koncentracija gali keistis greičiau ir tolygiai, palyginti su suaugusio organo atveju.
Rezultatas patvirtino metodą, tuo pačiu padarydamas mastelio problemą labiau matomą.
Mastelio problema skirstoma į keturias problemas
1. Krioprotektanto toksiškumas
Koncentracija, reikalinga vitrifikacijai, gali sutrikdyti baltymus, membranas ir ląstelinį metabolizmą. Toksiškumas priklauso nuo veiksnio, koncentracijos, temperatūros, poveikio trukmės ir audinio tipo.
Tai reiškia, kad „mažiau toksiškas“ nėra vienos molekulės savybė. Tai yra visos įkrovimo ir iškrovimo procedūros savybė.
2. Osmosinis stresas
Koncentruoto tirpalo įdėjimas ištraukia vandenį iš ląstelių. Jo pašalinimas gali grąžinti vandenį per greitai.
Šiuolaikiniai protokolai naudoja koncentracijos nuolydžius, nešiklių tirpalus, temperatūros kontrolę ir neprasiskverbiančius tirpalus, kad išlaikytų tūrio pokyčius toleruojamose ribose.
3. Netolygus tiekimas
Organas nėra vienalytis skysčio indas. Krioprotektantas keliauja per kraujagysles, kerta kapiliarų sieneles ir difunduoja per audinį.
Kraujo krešuliai, edema, kraujagyslių ligos, išemija ir kraujo-smegenų barjeras gali palikti kai kurias sritis žemiau koncentracijos, reikalingos ledo susidarymui slopinti.
Štai kodėl šiuolaikiniaiperfuzijos matavimai atsižvelgia į slėgį, srautą, temperatūrą ir veninę koncentraciją, o ne vien į tirpalo tūrį.
4. Terminiai gradientai
Didelis objektas atvėsta išorėje į vidų. Skirtingos temperatūros sukelia skirtingus susitraukimo greičius.
Šalia ir žemiau stiklo pereinamosios būsenos medžiaga negali greitai atpalaiduoti įtempio. Jei įtempis viršija jos mechaninį stiprumą, gali susidaryti įtrūkimai.
Tirpalas buvo kontroliuojamas atvėsinimo greičio, atkaitinimo šalia Tg ir lėtesnio nusileidimo per stiklinę sritį. Šie principai dabar formuojakompiuterio valdomą žmogaus atvėsinimą.
1990s ir 2000s: mišiniai pakeičia vieno reagento sampratą
Nė vienas krioprotektantas neoptimizavo visų reikalavimų. Tyrėjai vis dažniau derino prasiskverbiančius reagentus, kad kiekvienas galėtų prisidėti be savo blogiausios individualios koncentracijos pasiekimo.
Nešiklių tirpalai kontroliavo jonus, pH ir osmosinius sąlygas. Neprasiskverbiančios polimerinės medžiagos įtakojo audinių vandenį ir kraujagyslių elgseną.
Sintetiniai ledo blokatoriai buvo nukreipti į heterogeninį ledo branduolio formavimąsi ir augimą. Jie sumažino priklausomybę nuo grubaus jėgos krioprotektanto koncentracijos vienumo.
Tirpalai, tokie kaip VS55 ir vėliau M22, atspindėjo sistemų inžineriją: keli reagentai, ledo blokatoriai ir kruopščiai suprojektuota nešiklio chemija, derinami su apibrėžtais perfuzijos ir terminių protokolų principais.
Atsiliepimas apie organų vitrifikaciją,2004 aprašo pažangą toksinių medžiagų mažinime, šalimo pažeidimuose, branduolio formavimosi kontroleje ir organų perfuzijoje.
Svarbiausias progresas nebuvo toksinių medžiagų išnykimas. Tyrėjai išmoko paskirstyti naštą tarp chemijos, laiko ir temperatūros.
Triušio inkstų eksperimentai: svarbūs ir lengvai pervertinami
Kanino inksto darbai parodė, kad kraujagysliuotas žinduolių organas gali būti užpildytas sudėtingu vitrifikacijos tirpalu, atvėsintas į stiklo būseną, sušildytas ir transplantuotas.
Vienas praneštas inkstas palaikė kaniną kaip vienintelį funkcionuojantį inkstą ilgesnį laikotarpį.
Šis rezultatas yra svarbus, nes jis perkėlė tyrimą iš mikroskopinių mėginių į organo funkciją. Jis neužtikrino patikimos klinikinės procedūros.
Vėlesnėje literatūroje pažymima, kad ilgalaikio transplantacijos sėkmės nebuvo galima pakartotinai pasiekti. Distribucija, toksiškumas ir įprastas paviršinis sušildymas liko ribojančiais veiksniais.
Tai yra teisingas epistemologinis statusas: reikšmingas principo įrodymas su pakartojamumo ir mastelio problema.
2015: konservavimo kokybė tampa matoma sinapsių mastelyje
Aldehidais stabilizuota krioprezervacija sujungė cheminį fiksavimą, krioprotektanto perfuziją ir vitrifikaciją triušio ir kiaulės smegenyse.
Šis2015 tyrimas pranešė apie aiškias membranas, sinapses, pūsleles, mieliną ir intraceliulines struktūras po sušildymo ir paruošimo elektroninei mikroskopijai.
Jis parodė, kad puiki neuronų ultrastruktūra gali išlikti per ledų neturinčio laikymo ciklą dideliuose smegenyse.
Jis neparodė gyvybingo atsigavimo. Aldehido fiksavimas sąmoningai sujungia biologinį medžiagą ir yra nesuderinamas su įprastu gyvybinės funkcijos atkūrimu.
Eksperimentas atsakė į struktūrinį klausimą, o ne į visiško atgijimo klausimą.
Jo platesnis indėlis buvo metodologinis: konservavimą reikėtų vertinti tikrinant struktūras, kurios jums rūpi, o ne vien stebint, ar mėginys atrodo stikliškas.
2023: nanokaitinimas sprendžia atšilimo problemą žiurkių inkstuose
Atšaldymas yra tik pusė grįžtamosios kriokonservacijos. Atšilimas dažnai būna sunkesnis.
Jei atšilimas per lėtas, ledo kristalai gali augti per stiklinimo procesą. Jei šiluma ateina daugiausia iš paviršiaus, terminiai gradientai gali sužaloti organą.
Nanokaitinimas sprendžia abi problemas, paskirstydamas geležies oksido nanodaleles per kraujagysles ir kaitindamas jas kintamuoju radijo dažnio magnetiniu lauku.
2023 tyrėjaivitrifikavo žiurkių inkstus, laikė juos iki 100 dienų, nanokaitino ir persodino.
Atkurti inkstai atkūrė gyvybę palaikančią inkstų funkciją recipiento organizme, neturėjusio savų inkstų, per praneštą stebėjimo laikotarpį.
Šis pasiekimas priklausė ne vien nuo sušildymo. Komanda pakeitė toksiškesnį preparatą ir modeliavo krioapsauginių medžiagų įkrovimą, siekiant pagerinti audinių koncentraciją.
Tai yra kartojamasis pamokos vitrifikacijos istorijoje: išsprendus vieną kliūtį, atsiranda kita, o sėkmingas atkūrimas reikalauja visos grandinės.
2024 į 2026: didesnės fizinės sistemos ir funkcinis nervinis audinys
2024 tyrėjai pranešėfizinę vitrifikaciją žmogaus organo mastu0.5 į 3 litrų sistemose.
Jie sujungė vidinį termometravimą, atkaitinimą, kontroliuojamą aušinimą ir mikro-CT apžiūrą. Jie taip pat demonstruoja nanoušildymą tūriuose iki 2 litrų.
Didžiausi demonstraciniai bandymai buvo daugiausia fiziniai. Atsižvelgiant į tai, kad matomos ledo kristalų formavimasis ir įtrūkimai yra nepageidaujami, tai nereiškia biologinio atkūrimo įmanomumo žmogaus dydžio organui.
2026PNAS tyrimaspranešė trumpalaikį funkcinį atkūrimą suaugusio pelės hipokampo audinio po vitrifikacijos ir atšilimo.
Tyrimas įvertino morfologiją, mitochondrių atsako gebėjimą, neuronų sužadinamumą, sinapsinį perdavimą ir ilgalaikį potencialinį stiprinimą.
Jis apėmė pelės smegenų pjūvius ir mažo našumo visos smegenys preparatus, o ne žmogaus smegenis. Jo reikšmė siauresnė, bet vis dar reikšminga.
Jis parodė, kad suaugusio žinduolio nervinis audinys gali atkurti elektrofiziologines funkcijas po to, kai molekuliniam judėjimui sustojus stiklo būsenoje.
Žmogaus biostazė paveldi šį mokslinį pagrindą, tačiau susiduria su sunkesnėmis sąlygomis
Organų bankavimo eksperimentai pradedami nuo sveiko audinio, kontroliuojamo laiko ir planuoto priėjimo prie kraujagyslių.
Žmogaus biostazė pradedama po teisinės mirties. Liga, šiltoji ischemija, krešėjimas, edema, transportavimas ir kraujagyslių liga gali visi pakenkti krioapsauginių medžiagų pristatymui.
Immediate objective is structural preservation for possible future repair, not present-day reversible transplantation.
Šis skirtumas paaiškina, kodėl laboratorinių teiginių negalima tiesiogiai perkelti į teiginius apie pacientus.
Kaip Tomorrow.bio pritaikė vitrifikaciją lauko sąlygoms
Tomorrow.bio perkėlė visos kūno krioprotekcinę perfuziją į specializuotas greitojo reagavimo mašinas. Procedūra gali būti pradėta netoli paciento, o ne laukiant, kol bus nugabentas į Šveicariją.
Tai keičia svarbų veiksnį, kurio chemija negali pataisyti: tai yra, kiek truko išemija prieš perfuziją.
Dabartinis protokolas naudoja VM-1 pagrindu sukurtą cheminį tirpalą, pritaikytą lauko krioprotekcijai ir vėlesniam sausojo ledo transportui.
„EBF mokslinio tyrimo programa yra išbandžiusi VM-1 modelį, imituojant mirties po sąlygas, įskaitant tris valandas trukusią šiltą išemiją.
Programa matavo veninį lūžio rodiklį, perfuzijos trukmę, svorio pokytį, smegenų susitraukimą ir ledo formavimąsi, testuojant cheminio tirpalo ir procedūros pakeitimus.
Tai yra praktinė riba žmogaus atvejais: ne tai, ar idealus tirpalas gali vitrifikuoti, bet tai, kaip gerai realus išeminis pacientas gali būti perfuzuotas.
Matavimas tapo dalimi procedūros
Ankstyvoje vitrifikacijos tyrimų fazėje sėkmė dažnai buvo nustatoma permatomumu, kalorimetrija, rentgeno difrakcija, atšilimo po atšildymo ar funkcijos atkūrimu.
Žmogiškoji biostazė negali šiandien naudoti atsigavimo kaip dabartinio tikslo. Todėl jai reikia nedestruktyvių ir imčių pagrįstų matavimų, siekiant įvertinti konservavimo kokybę.
Tomorrow.bio atlieka CT skenavimą kiekvienam pacientui esant toje pačioje skysto azoto temperatūroje, siekiant įvertinti krioprotektanto pasiskirstymą ir identifikuoti ledą ar makroskopinius defektus standartizuotomis sąlygomis.
Su atskiru sutikimu, neuraliniai mikromėginiai gali padėti atlikti elektroninės mikroskopijos tyrimą, vertinant membranas, sinapses ir vietinę ultrastruktūrą.
Šie metodai ir jų ribos yra aprašyti „biostazės kokybės kontrolės procedūrose.“
Matavimai keičia pačią plėtrą. Kai klaida tampa matoma ir palyginama tarp atvejų, chemijos ir protokolo pakeitimai gali būti nukreipti į ją.
Kas pagerėjo, o kas dar neišspręsta
Šiuolaikinė vitrifikacija pasiekė keletą dalykų, kurių ankstyvoji užšaldymo technika negalėjo:
- Ledo neturinti daugelio ląstelių, embrionų ir mažų audinių konservacija.
- Vitrifikuotų gyvūnų organų funkcinis atkūrimas apibrėžtuose eksperimentuose.
- Sinapsių mastelio struktūrinė konservacija fiksuotuose žinduolių smegenyse.
- Kompiuterio valdomos aušinimo ir atkaitinimo procedūros didesniems sistemoms.
- Tūrinis atšilimas naudojant technologijas, tokias kaip nanoušilimas.
- KT ir elektroninės mikroskopijos metodai realių konservacijos rezultatų matavimams.
Ji nėra sukūrusi grįžtamosios žmogaus viso kūno krioprezervacijos.
Likę problemų apima postmortalinį išeminį pažeidimą, netolygų perfuziją, krioprotektantų toksiškumą, kraujo-smegenų barjero poveikį, viso kūno šiluminius gradientus, lūžio vengimą ir saugų tolygų atšilimą.
Net sėkminga struktūrinė konservacija paliktų ateities problemas, susijusias su atkūrimu, atgaivinimu ir gydymu dėl mirties priežasties.
Šie skirtumai yra plėtojamitechniniuose iššūkiuose grįžtamajai krioprezervacijai.
Trumpai: Vitrifikacija tobulinama gerinant krioprotektantus, perfuziją, ledo kontrolę, aušinimą, atšilimą ir struktūrinį matavimą. Kai kurie problemų sprendimai taikomi mažais masteliais, tuo tarpu viso žmogaus grįžtamumas lieka neišspręstas.
Išbandykite šią praktinę priemonę
Naudokite interaktyvią priemonę, kad išnagrinėtumėte šiame straipsnyje keliamą klausimą.
Įkeliama interaktyvi priemonė...
Daugiau skaityti